紫外分光光度法測定dna蛋白質(zhì)含量
美析儀器有限公司
一、實驗?zāi)康?br>?學(xué)習(xí)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理；
?掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實驗技術(shù)；
?掌握uv-1700紫外可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。
二、實驗原理
紫外可見吸收光譜法又稱紫外可見分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對光的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外可見吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價電子躍遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜.
定性分析:利用紫外可見吸收光譜法進行定性分析一般采用光譜比較法。即將未知純化合物的吸收光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、相對強度以及吸收峰的形狀與已知純化合物的吸收光譜進行比較。
定量分析:紫外可見吸收光譜法進行定量分析的依據(jù)是朗伯-比爾定律：a=lgi0/i=εbc，當(dāng)入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度a與該物質(zhì)的濃度c成正比，即物質(zhì)在一定波長處的吸光度與它的濃度成線形關(guān)系。因此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì)濃度和含量。由于zui大吸收波長λmax處的摩爾吸收系數(shù)zui大，通常都是測量λmax的吸光度，以獲得zui大靈敏度。
光度分析時，分別將空白溶液和待測溶液裝入厚度為b的兩個吸收池中，讓一束一定波長的平行單色光非別照射空白和待測溶液，以通過空白溶液的透光強度為i0，通過待測溶液的透光強度為i，根據(jù)上式，由儀器直接給出i0與i之比的對數(shù)值即吸光度。
紫外可見分光光度計:紫外可見吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計，它的主要部件有五個部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測器、信號顯示器；
由光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)過單色器分光后即可獲得任一所需波長的平行單色光,該單色光通過樣品池靜樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測器上產(chǎn)生光電流，產(chǎn)生的光電流由信號顯示器直接讀出吸光度a?？梢姽鈪^(qū)采用鎢燈光源、玻璃吸收池;紫外光區(qū)采用氘燈光源、石英吸收池。
本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中*和*殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其zui大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別）。在zui大吸收波長處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系服從朗伯-比耳定律。該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點。
三、儀器與試劑
uv-1700美析儀器-紫外可見分光光度計，比色管，吸量管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00mg.ml-1溶液0.9%nacl溶液，待測蛋白質(zhì)溶液
四、實驗步驟
〈一〉準(zhǔn)備工作
啟動計算機，打開主機電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器。在工作界面上選擇測量項目（光譜掃描，光度測量），本實驗選擇光度測量，設(shè)置測量條件（測量波長等）。3.將空白放入測量池中，點擊start掃描空白，點擊zero校零。
4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。
〈二〉測量工作
1.吸收曲線的繪制:
用吸量管吸取2ml5.00mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10ml比色管中，用0.9%nacl
溶液稀釋至刻度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9%nacl溶液為參比，在190nm～400nm區(qū)間，測量吸光度。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：
用吸量管分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml5.00mg.ml-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10ml比色管中，用0.9%nacl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9%nacl溶液為參比，在280nm處分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度a278
記錄所得讀數(shù)。
3.樣品測定：
取適量濃度的待測蛋白質(zhì)溶液3ml，按上述方法測定278nm處的吸光度。平行測定三份。
五、數(shù)據(jù)處理：
1.以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線，找出zui大吸收波長。
由吸收曲線可得zui大吸收波長λmax=278nm(圖略)
2.以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c(mg/ml)
吸光度a0.250.1710.500.3350.750.4821.000.6371.25
標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c(mg/ml)
y=0.6208x+0.0186r2
=0.9998
濃度c-吸光度a標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是：a=0.6208*c+0.0186
3.根據(jù)樣品蛋白質(zhì)溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度。
平行測定次數(shù)樣品液吸光度a樣品溶液濃度c(mg/ml)
10.6761.05920.6721.05330.6741.056
所測溶液平均濃度:c=(c1+c2+c3)/3=1.056mg/ml
測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差：s=√σ(xi－x)2/(n－1)=0.003
待測蛋白質(zhì)溶液濃度為：1.056mg/ml*10ml/3ml=3.520mg/ml。