無論用什么方法制備抗體,也不論制備何種抗體。制備的抗體的功能驗證是十分重要的,而功能驗證的前提是要得到高純度的蛋白。通常我們使用的驗證功能的方法是間接法elisa檢測。間接elisa的原理這里不再贅述,但我們需要確定所用酶標抗體,這通常是表達的蛋白上所帶有的標簽蛋白的抗體。在此我們以噬菌體表面展示為例,說明抗體制備的elisa鑒定抗體選擇。
首先對表面展示相關(guān)載體做一個介紹:
padl-10 low-display phagemid vector series:
the phagemid padl-20 vector series:
padl-100 maximum display phagemid vector series:
fadl m*lent phage vector series:
phal30:
phen:
pcantab:
這里只展示了一些載體的圖譜,但通過這些載體的組成,我們可以了解到:用噬菌體展示技術(shù)制備抗體時,選擇的噬菌體或嗜菌粒表面展示載體通常都帶有標簽蛋白——
his標簽:該融合標簽是由六個組氨酸殘基組成的,可于目的蛋白的c端或n端插入,是蛋白純化較常用的標簽,可以利用鎳柱將與his標簽融合表達的目的蛋白進行純化,增加蛋白的純度。
hemagglutinin (ha)標簽:該標簽含有9個氨基酸,序列為ypydvpdya,其源于流感病毒紅細胞凝集素表面的抗原決定簇,對目的蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響小, 易融合表達到目的蛋白的n端或c端。易于用anti-h(huán)a抗體進行elisa等檢測。
myc標簽:該標簽含有10個氨基酸,標簽序列為eqkllseedl,可融合表達至目的蛋白的n端或c端。這10個氨基酸表達在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可作為抗原表位識別其相應抗體,因此myc tag已成功應用在 western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細胞計量術(shù)中, 用于檢測目的重組蛋白的表達。
甚至有時候會帶上兩個標簽,his+ha,his+myc,進行兩種親和層析的純化,以得到高純度、高特異性甚至高溶解性的目的蛋白。
除了標簽抗體,噬菌體表面展示有時候還會用到m13抗體,接下來我們介紹一些m13重組抗體的商品情況:抗m13 的m13 major coat protein(rl-ph1, igg2b kappa light chain單克隆克隆抗體),m13酶標抗體(anti-m13(hrp)antibody),m13 g8p 抗體和hrp 酶標 m13 抗體(arigo)。酶標抗體可以直接用于elisa檢測,減少了二抗的使用,可以節(jié)約時間和成本。如果利用間接elisa方法使用酶標二抗進行檢測,在構(gòu)建載體的過程中也不需要加入標簽,可以直接進行噬菌體的elisa檢測,也不必擔心標簽的引入對抗體表達的影響。
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