pcr引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。引物是pcr特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，因此，pcr的首要任務(wù)就是引物設(shè)計。那么你知道pcr引物設(shè)計的關(guān)鍵點(diǎn)有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！
一、引物最好在模板cdna 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計
dna序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在ncbi上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如dnaman）比對（alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。
二、引物長度一般在15~30 堿基之間
引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于taq dna 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
三、引物gc 含量在40%~60%之間，tm 值最好接近72℃
gc含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的gc含量不能相差太大。另外，上下游引物的tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于tm值5~10℃。若按公式tm= 4（g+c）+2（a+t）估計引物的tm 值，則有效引物的tm為55~80℃，其tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。
四、引物3′端要避開密碼子的第3 位
如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。
五、引物3′端不能選擇a，最好選擇t
引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為a 時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為t 時，錯配的引發(fā)效率大大降低，g、c 錯配的引發(fā)效率介于a、t 之間，所以3′端最好選擇t。
六、引物應(yīng)具有特異性
引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進(jìn)行blast 檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。
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