體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位紅色熒光（tmrm）試劑盒資料
主要用途活體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位紅色熒光（tmrm）測(cè)定試劑是一種旨在通過(guò)四甲基羅丹明甲酯染料，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體膜電位的變化，即內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低，來(lái)分析線粒體內(nèi)膜功能的完整性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種線粒體制備物的功能檢測(cè)?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，活體檢測(cè)，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位紅色熒光（tmrm）試劑盒資料
四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；tmrm），為羅丹明衍生物陽(yáng)離子染料，作為電勢(shì)測(cè)定（potentiometric）熒光探針：*，具有親脂性，且細(xì)胞低毒和光穩(wěn)定； 第二，與線粒體內(nèi)膜負(fù)電極結(jié)合而聚集；第三，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。四甲基羅丹明甲酯進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進(jìn)入線粒體后，被線粒體俘獲，分布和結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上，呈現(xiàn)強(qiáng)烈熒光。線粒體膜電位的高低變化決定了tmrm的分布濃度。電位高，tmrm在線粒體的濃度高，顯示為強(qiáng)力紅色或桔紅色；反之，tmrm彌散在胞漿內(nèi)，熒光減弱表明線粒體膜電位受到損害。
產(chǎn)品內(nèi)容
染色液（reagent a） 100微升
稀釋液（reagent b） 10毫升
清理液（reagent c） 50毫升
強(qiáng)化液（reagent d） 1毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書 1份
保存方式
保存清理液（reagent c）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（reagent a）避免光照；有效保證6月
用戶自備
體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位紅色熒光（tmrm）試劑盒資料
*乙二胺四乙酸混合液（gms12024）：用于細(xì)胞脫離
*細(xì)胞培養(yǎng)液（gms12052）：用于細(xì)胞脫落收集
1.5毫升離心管：用于活體細(xì)胞線粒體染色的容器
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞收集的操作
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于活體細(xì)胞線粒體熒光定性分析
比色皿或96孔板：用于熒光定量分析的容器
熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于活體細(xì)胞線粒體熒光定量分析
細(xì)胞流式儀：用于活體細(xì)胞線粒體熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（reagent a）置入冰槽里融化，稀釋液（reagent b）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出10微升染色液（reagent a）到新的1.5毫升離心管，加入890微升稀釋液（reagent b），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。
一、直接法
準(zhǔn)備1個(gè)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá)70％（約105細(xì)胞數(shù)）小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕沿著孔壁加入1毫升清理液（reagent c）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面（選擇步驟）加入50微升強(qiáng)化液（reagent d），輕輕混勻（選擇步驟）冰上孵育5分鐘小心抽去1毫升清理液（reagent c） 加入450微升含有染色液（reagent a） 和稀釋液（reagent b）的染色工作液，覆蓋培養(yǎng)孔表面放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）小心抽去450微升染色工作液小心加入500微升清理液（reagent c）（注意：檢測(cè)前置于冰槽里）即刻在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察（濾波器激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm）――可見亮橘紅色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞
二、間接法
準(zhǔn)備1個(gè)12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá)70％（約30萬(wàn)細(xì)胞數(shù)）小心移出細(xì)胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細(xì)胞）加入1毫升清理液（reagent c）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面小心移出1毫升清理液（reagent c）到15毫升錐形離心管（收集洗脫細(xì)胞）加入500微升用戶自備的*乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔表面置入37℃培養(yǎng)箱1分種輕輕抖動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞脫落，然后加入1毫升*細(xì)胞培養(yǎng)液移入15毫升錐形離心管放進(jìn) 臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g小心抽去上清液加入50微升清理液（reagent c）用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群轉(zhuǎn)入到1.5毫升離心管或細(xì)胞流式儀測(cè)試管加入450微升含有染色液（reagent a） 和稀釋液（reagent b）的染色工作液輕度渦旋震蕩2秒放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）放進(jìn) 臺(tái)式微型離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g小心抽去上清液加入500微升清理液（reagent c）（注意：檢測(cè)前置于冰槽里）
選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察
混勻后，移出50微升在載玻片上即刻進(jìn)行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察（濾波器激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm） ――可見亮橘紅色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞
選擇二、細(xì)胞流式儀分析
混勻后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：觀察50000個(gè)細(xì)胞以上
激發(fā)波長(zhǎng)
488nm
匹配熒光染料
藻紅蛋白（phycoerythrin；pe）
熒光顏色
紅色
散發(fā)波長(zhǎng)
575
流式儀通道
fl2
熒光增強(qiáng)
膜電位正常
選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定
混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里即刻進(jìn)行熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定（激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm），獲得相對(duì)熒光單位（rfu）：rfu值高表明線粒體膜電位正常
注意事項(xiàng)
本產(chǎn)品為20次（0.5毫升工作液）操作操作時(shí)，須戴手套待測(cè)細(xì)胞建議不要過(guò)于饑餓或過(guò)度生長(zhǎng)建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析孵育時(shí)，避免光照健康細(xì)胞和線粒體呈現(xiàn)橘紅色；死亡或凋亡細(xì)胞及損傷線粒體呈現(xiàn)黯淡或無(wú)熒光本公司提供fccp溶液，作為線粒體膜電位破壞分子，觀察熒光顯著減弱現(xiàn)象參考圖像熒光顯微鏡：左側(cè)為正常樣品；右側(cè)為處理樣品
2）細(xì)胞流式儀：上圖為正常樣品；下圖為fccp處理樣品
本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品