l本試劑盒用于體外定性檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中人支原體igm抗體（mabigm）。
l有效期：6個月
l保存條件：2-8℃
實驗原理試劑盒采用間接法酶聯免疫吸附試驗（elisa）。往預先包被人支原體igm抗體（mabigm）捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標本、陰性和陽性對照，再加入hrp標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物tmb顯色，tmb在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人支原體igm抗體（mabigm）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（od 值），判定陰陽性。
樣本處理及要求
1.血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.血漿：用edta或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 組織勻漿：用預冷的pbs (0.01m, ph=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的pbs（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9ml的pbs，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
需要而未提供的試劑和器材
1.酶標儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
微孔酶標板
96孔
48孔
無
陰性對照
0.3ml
0.3ml
無
陽性對照
0.3ml
0.3ml
無
樣本稀釋液
6ml
3ml
無
檢測抗體-hrp
10ml
5ml
無
20×洗滌緩沖液
25ml
15ml
按說明書進行稀釋
底物a
6ml
3ml
無
底物b
6ml
3ml
無
終止液
6ml
3ml
無
封板膜
2張
2張
無
說明書
1份
1份
無
自封袋
1個
1個
無
注意事項
1.嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2.洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響od值。
4.底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。
5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。
6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8.任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
9.不能使用過期產品。
10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
試劑準備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置陰性對照孔、陽性對照孔和樣本孔，陰性、陽性對照孔各加50μl對照品，樣本孔中加入待測樣本50μl，空白孔不加。
3.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（hrp）標記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
4.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μl），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
5.每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。
6.每孔加入終止液50μl，15min內，在450nm波長處測定各孔的od值。
實驗結果計算
1.陰性對照od值：小于0.2。
2.陽性對照od值：大于0.8。
3、陽性判斷（cut-off值）：陰性對照od值+0.25，樣本od值大于閾值，判定為陽性，反之，為陰性。
4、重復性：板內變異系數小于15%。
5、儲藏：2-8℃避光密封保存。
關鍵詞：酶標儀 恒溫箱 水浴鍋 洗板機